T細胞亞群檢測試劑盒說明書

一：試劑盒組成：

二：標(biāo)本制備：

取肝素抗凝（25μl/ml）的靜脈血1～2ml，PBS稀釋1-2倍后，沿裝有等量淋巴細胞分離液的試管壁混勻緩慢加至液面上層，保持兩種液體界面清晰，離心（2000轉(zhuǎn)/分）15-20分鐘，吸取兩液面交界處的單個核細胞層，加5倍PBS，離心（1000轉(zhuǎn)/分）5分鐘，棄上清液，沉淀即為單個核細胞。利用試管中剩余的少許回流液體（約一滴）混勻細胞，制成單個核細胞懸液。滴30μl細胞懸液于載玻片上，靜置2分鐘使細胞下沉粘附于玻片上，吸去液體，快速吹干或37℃溫箱1小時烤干?；蛴肞BS將單個核細胞調(diào)至2×10⁵個/ml，離心涂片機1000轉(zhuǎn)離心1-2分鐘制片，快速吹干或37℃溫箱1小時烤干。涂片前取防脫片劑5-10μl均勻推片，亦可用棉簽粘取防脫片劑均勻涂于干凈玻片上，待干后制備細胞涂片，以防掉片。

三：顯色劑的配制：

分別取A液25ul，B液25ul置于干凈試管中混勻，室溫放置2-5分鐘，加1ml蒸餾水，混勻，再加C液100ul待用。

*使用前，根據(jù)所需顯色劑用量，按照以上比例現(xiàn)配現(xiàn)用。

四：標(biāo)本染色：

1. 充分干燥（室溫2小時以上或過夜）的細胞涂片先用記號筆在標(biāo)本外畫圈，然后滴加固定液50μl，室溫靜置2-3分鐘，用PBS淋洗，擦干玻片背面及細胞外的PBS。

*以下反應(yīng)均需在濕盒中進行。

2. 分別滴加抗人CD3、CD4、CD8單抗適量(10-30μl）,4℃過夜，PBS淋洗3次。

3. 滴加生物素標(biāo)記抗小鼠IgG適量（10-30μl），37℃孵育30-45分鐘，PBS淋洗3次。

4. 滴加堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉卵白素適量（10-30μl）37℃孵育30-45分鐘，PBS淋洗3次。

5. 滴加顯色劑30-50μl，室溫顯色20-40分鐘。可在顯微鏡下觀察，待細胞膜上出現(xiàn)紅色標(biāo)記物時，用PBS淋洗。

6. 滴加細胞核復(fù)染液30-50μl，30秒后自來水淋洗。

7. 滴加封片劑，蓋片封片，鏡檢。如不需保存亦可用水替代封片劑蓋片鏡檢。

五：觀察：

高倍鏡下選取染色好的視野記數(shù)100-200個單個核細胞，細胞表面有紅色標(biāo)記物為陽性細胞。算出陽性率。

六：正常參考值：

正常人外周血中，陽性細胞百分率一般在：CD3，60-80%；CD4，35-55%；CD8，20-30%；CD4/CD8的比值在1.5-2.0范圍內(nèi)。

七：儲存條件及有效期：

2-8℃保存，禁止冷凍，有效期為12個月。有效期內(nèi)可在0-25℃范圍內(nèi)七天短時運輸。使用時應(yīng)及時及拿及用，使用后應(yīng)立即放回冰箱。生物試劑日期，使用期限或失效日期見標(biāo)簽。

八：注意事項：

1. 免疫細胞化學(xué)檢測是一種包含多步驟的檢測方法，試劑的選擇、樣本的處理、涂片的制備、染色及其結(jié)果的判讀均需要進行專業(yè)的培訓(xùn)。

2. 任何陽性或陰性的解讀，應(yīng)由病理科醫(yī)生結(jié)合病理形態(tài)學(xué)，研究表現(xiàn)及其它檢測方法進行，不作為單獨的診斷指標(biāo)。

3. 復(fù)染過度或不足都可能影響結(jié)果的判讀。

4. 陰性結(jié)果表示未檢出抗原，不一定表示樣本中無該抗原存在，待測抗原編碼基因變異，抗原低表達或抗原修復(fù)不當(dāng)?shù)?，都會造成抗原無法檢出。

5. 本試劑僅對經(jīng)處理的人外周血細胞進行驗證，不做其他用途

6. 試劑盒使用中，應(yīng)有適當(dāng)?shù)姆雷o措施，以避免試劑同皮膚和眼睛接觸。