脾臟淋巴細(xì)胞分離試劑盒的操作說(shuō)明

規(guī)格：200 mL/kit

保存：本產(chǎn)品對(duì)光敏感，應(yīng)該室溫避光儲(chǔ)存，保質(zhì)期2 年。無(wú)菌開(kāi)封后，保存于室溫。

試劑盒組成：

各種動(dòng)物脾臟淋巴細(xì)胞分離液 200mL

全血及組織稀釋液 200mL

細(xì)胞洗滌液 200mL

淋巴細(xì)胞分離方法（僅供參考）

1. 制備脾臟的單細(xì)胞懸液。

2. 取一支適當(dāng)?shù)碾x心管，加入與脾臟單細(xì)胞懸液等量的分離液（分離液最少不得少于3 mL，總體

積不能超過(guò)離心管的三分之二，否則會(huì)影響分離效果）。

3. 小心吸取單細(xì)胞懸液加于分離液液面上，注意保持兩液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸

取單細(xì)胞懸液，然后小心的平鋪于分離液上，因?yàn)閮烧叩拿芏炔町?，將形成明顯的分層界面。）

4. 室溫，水平轉(zhuǎn)子500~900g，離心20~30min。（根據(jù)脾臟單細(xì)胞懸液的量確定離心條件，單細(xì)胞

懸液量越大，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件可以自

行摸索，以達(dá)到最佳分離效果）。

5. 離心后，此時(shí)離心管中由上至下細(xì)胞分四層。第一層為稀釋

液層；第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層；第三層為透明分離液

層；第四層為紅細(xì)胞層。

6. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞至另一潔凈的

15mL離心管中，向離心管中加入10ml細(xì)胞洗滌液洗滌白膜層細(xì)

胞，250g，離心10min。

7. 棄上清，5mL的PBS或細(xì)胞清洗液重懸細(xì)胞，250g，離心

10min。

8. 重復(fù)步驟7

9. 棄上清，細(xì)胞重懸備用。

脾臟單細(xì)胞懸液的制備方法（僅供參考）

脾臟研磨的方法：

1. 無(wú)菌條件下摘取脾臟，撕去脾臟被膜，用眼科剪將脾臟剪成小塊。

2. 將尼龍篩網(wǎng)或者是細(xì)胞過(guò)濾篩放置于平皿上，加入少量全血及組織稀釋液（保證脾臟及獲得的

細(xì)胞處于液體環(huán)境中）。

3. 將脾臟放置于篩網(wǎng)上，使用注射器活塞或者是無(wú)菌鑷子來(lái)研磨脾臟（盡量控制研磨力度，保持

篩網(wǎng)懸空，避免在皿底上直接研磨而造成大批細(xì)胞死亡）

4. 研磨后使用全血及組織稀釋液沖洗篩網(wǎng)，收集細(xì)胞懸液，再經(jīng)濾網(wǎng)過(guò)濾。

注：

分層示意圖

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A. 可用酶消化法，使用膠原酶對(duì)脾臟組織進(jìn)行消化，得到單細(xì)胞懸液。

B. 如果最終得到的細(xì)胞需要培養(yǎng)，那全過(guò)程所需試劑與器材均要求無(wú)菌。

C. 根據(jù)脾臟的體積控制單細(xì)胞懸液的濃度在108~109個(gè)/mL。

注意事項(xiàng)：

A. 開(kāi)封前顛倒混勻，本分離液為無(wú)菌產(chǎn)品，為延長(zhǎng)分離液保存時(shí)間，請(qǐng)?jiān)跓o(wú)菌條件下啟封，避免

微生物污染。

B. 分離液使用時(shí)應(yīng)始終保持室溫（18℃~25℃），如室內(nèi)溫度較低，可將分離液預(yù)熱。4℃或者是

溫度較低的條件下離心，可能會(huì)導(dǎo)致白膜層中紅細(xì)胞污染加重。

C. 待分離的組織要求新鮮，避免冷凍和冷藏。

D. 部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其帶有的靜電作用，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞掛壁，影響分離效果。

E. 如果要進(jìn)一步對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，那在制備單細(xì)胞懸液和分離過(guò)程中，注意無(wú)菌操作，避

免微生物污染。

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